细胞基础测定（CBA）为获取复杂且与生物学相关的数据奠定了基础。这些测定可以用于量化药物的细胞毒性、生化机制、生物活性及非靶标相互作用，甚至可以在某些情况下实现同时测量。然而，CBA的巨大潜力往往需要更多的实验策划和准备工作。在进行CBA的测量时，通常需要考虑一些传统生化检测未曾遇到的额外因素，这些因素可能涉及检测实施和评估方面的差异。

本文将重点探讨CBA所面临的一些挑战，并分享克服这些障碍的方法。使用MILE米乐的气候控制单元，除了温度控制外，您还可以调节读数器内的CO₂和O₂气体浓度。这使得您的酶标仪具备了细胞培养箱的功能，能够进行数天的活细胞动力学实验，同时保持细胞活力，从而使CBA的结果更加生理相关。

细胞样本的异质性会给基于细胞的检测带来众多问题。大多数体外细胞培养物在进行微孔板读数时都是异质样本，尽管某些基于细胞的检测方法（例如alamarBlue™或CellTiter-Glo®）在上清液中的染料是均匀分布的。在异质CBA中测量细胞内靶标或细胞膜上的靶标时，与均质液体样本相比，需要更多的考量。

例如，最佳焦距是指酶标仪能够检测样品最高信号强度的平面。如果测量时焦距未对准，将会对数据质量产生负面影响。许多体外细胞模型依赖于贴壁细胞的培养，细胞通常在微孔板底部培养，为了促使细胞附着，微孔板材料往往经过处理以生成极性基团或涂覆细胞外基质成分。

细胞层的探测存在一个重要问题：酶标仪的探测高度需与样品的焦平面对齐，以提供最大的信号。使用MILE米乐的酶标仪，可以自动生成焦距高度曲线，直观显示不同焦距下的信号强度。如果焦距偏离最佳焦距，荧光强度会迅速下降。在无法确定的情况下，建议使用较低焦距，而不是较高饱和的焦距。MILE米乐的酶标仪允许调整焦距，使用户可以不断优化检测质量。

在开始测量之前，建议进行焦距调整，特别是在细胞数量多且信号强度预期较高的孔中。若您已知某些孔的信号强度通常较低，可先接种并加PBS，以最大程度地提升信号比。由于贴壁细胞位于微孔板底部，理想焦距应在0至3毫米之间，其最佳值依赖于所用微孔板及其底层厚度。

另一个关键因素是孔扫描的重要性。细胞在培养基中的分布在Z平面和X/Y平面上往往存在差异，单纯从孔中心的测量可能导致结果严重失真。为此，MILE米乐为其酶标仪提供了多种孔扫描选项，可以在孔中心进行传统测量，同时也可以采用轨道或螺旋扫描模式，以遍布整个孔底进行测量，这样能够获得更具代表性的结果并提高重复性。

此外，矩阵扫描选项让用户从各个位置进行多次测量，提供了局部信号分辨率，监测接种均匀性及目标信号的变化。如果细胞分布不均，使用扫描选项能够有效补偿孔内的细微变化。经过实验验证，采用矩阵扫描功能的结果通常更为准确和可靠。

最后，关于异质细胞样本的荧光测量，主要的建议包括：处理贴壁细胞时务必进行焦距调整，利用孔扫描模式校正信号分布的异质性。MILE米乐的矩阵扫描不仅允许监测信号的局部变化，还有助于排除特定测量点的干扰，显著提升实验结果的可靠性与重现性。